Laboratorium Hemostazy - Artykuły

Analizator do badania funkcji płytek krwi (PFA, Platelet Function Analyser; Siemens Healthineers) jest powszechnie znanym narzędziem do przesiewowego badania czynności płytek krwi. Analizator ten opracowano 50 lat temu, pojawił się on na rynku w połowie lat 90-tych, a obecnie dostępny jest na rynku europejskim w dwóch modelach, tj. PFA-100 i PFA-200. Oba instrumenty działają w oparciu o pomiar tzw. czasu zamknięcia (CT, Closure Time). Pomiar CT był pierwotnie postrzegany jako równoważnik stosowanego wówczas pomiaru czasu krwawienia i przez pewien czas był znany jako „czas krwawienia in vitro”.

Hemofilia B jest uwarunkowaną genetycznie skazą krwotoczną, spowodowaną brakiem lub zmniejszeniem syntezy osoczowego czynnika krzepnięcia IX (FIX). Na podłoże molekularne hemofilii B składa się dość duża liczba (> 1200) różnych wariantów genetycznych o różnej lokalizacji, co dowodzi znacznej heterogenności tej skazy krwotocznej. Fenotyp krwotoczny hemofilii B nie zawsze idealnie koreluje z aktywnością koagulacyjną FIX:C w osoczu, dlatego poznanie mechanizmu molekularnego hemofilii B może być pomocne w zrozumieniu niejednorodności fenotypu krwotocznego i pogłębieniu wiedzy na temat diagnozowania i leczenia pacjentów obarczonych tą chorobą. W niniejszym artykule przedstawiono uwarunkowania molekularne hemofilii B wraz z omówieniem ich patomechanizmu w poszczególnych domenach FIX.

Trombomodulina (TM) jest transbłonową glikoproteiną typu I, odkrytą w 1981 roku na powierzchni komórek śródbłonka, jako kofaktor aktywacji białka C w reakcji katalizowanej przez trombinę. TM znaleziono na wielu różnych komórkach, w tym na makrofagach, monocytach, płytkach krwi, neutrofilach i komórkach mezotelium [1]. Śródbłonkowa, jednołańcuchowa TM o masie cząsteczkowej około 74 kDa, składa się z 557 aminokwasów. Strukturę dojrzałej TM tworzy pięć domen: domena lektynopodobna (TMD1), domena podobna do naskórkowego czynnika wzrostu - EGF (TMD2), domena bogata w serynę/treoninę (TMD3), domena transbłonowa (TMD4) oraz „ogon” cytozolowy (TMD5).

Zapraszamy do zapoznania się z relacją cyfrową z XXX Zjazdu PTHIT, zarejestrowaną podczas sesji dotyczącej diagnostyki laboratoryjnej w hemostazie.

Laboratorium kliniczne staje przed istotnym dylematem związanym z monitorowaniem leczenia bezpośrednimi doustnymi antykoagulantami (DOAC), obejmującymi bezpośredni inhibitor trombiny, eteksylan dabigatranu i trzy bezpośrednie inhibitory FXa: apiksaban, edoksaban i rywaroksaban: czy i w jaki sposób monitorować efekty ich działania. DOAC mają przewidywalne właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne w przypadku dawek ustalonych dla zatwierdzonych wskazań i nie wymagają rutynowego monitorowania w tym samym kontekście, co tradycyjne doustne leki przeciwzakrzepowe (VKA).  Obecnie wiadomo, że posiadanie przez laboratorium możliwości wykrywania lub pomiaru ilościowego DOAC może być korzystne w przypadku ostrych stanów, takich jak uraz, pilna operacja, udar mózgu i inne.  Pewne populacje pacjentów, do których należą osoby: starsze, szczupłe lub nadmiernie otyłe, z zaburzeniami czynności nerek, z podejrzeniem przedawkowania lub interakcji leków, mogą również wymagać takiej oceny. 

Złożone procesy krzepnięcia są zależne od procesów adhezji i aktywacji płytek krwi. Funkcja prokoagulacyjna płytek krwi jest związana z prawidłowym funkcjonowaniem szeregu mechanizmów.

VWD może być błędnie zdiagnozowana jako zupełnie inna skaza krwotoczna. Jeśli nie zostanie wykonany odpowiedni panel badań laboratoryjnych ukierunkowanych na VWD, to np. u pacjenta z ciężką postacią VWD typu 3 nieumyślnie może zostać zdiagnozowana hemofilia A, ze względu na niską aktywność FVIII stwierdzaną w obu tych schorzeniach.

ADAMTS13 jest metaloproteazą osocza, która reguluje multimeryczną wielkość czynnika von Willebranda poprzez rozszczepianie sekwencji aminokwasowej białka Tyr1605-Met1606. Niedobór ADAMTS13 (nabyty lub wrodzony) występuje w zakrzepowej plamicy małopłytkowej (TTP, thrombotic thrombocytopenic purpura).  TTP należy do grupy chorób określanych jako mikroangiopatie zakrzepowe (TMA, thrombotic microangiopathy), u podstaw których leży uogólniona zakrzepica tętniczek i naczyń włosowatych [1]. Wyróżnia się postać wrodzoną TTP (cTTP, congenital TTP), uwarunkowaną mutacjami w genie kodującym ADAMTS13 (tzw. zespół Upshaw-Schulmana, USS), oraz nabytą - immunologiczną (iTTP, immune mediated TTP), wynikającą z obecności autoprzeciwciał anty-ADAMTS13, czyli tzw. inhibitora [1].

Pojęcie „wyroby medyczne do diagnostyki in vitro (IVD)” obejmuje testy stosowane dla próbek biologicznych, służące wykrywaniu i monitorowaniu przebiegu chorób oraz diagnozowaniu i ich prognozowaniu w warunkach klinicznych, jak również testy genetyczne, co znacznie zwiększa zastosowanie IVD w różnych sytuacjach klinicznych.  W dniu 26 maja 2017 r. Parlament Europejski i Rada Unii Europejskiej przyjęły nowe rozporządzenie w sprawie wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro (IVDR) – Rozporządzenie UE 2017/746 – planowane do wprowadzenia od 26 maja 2022 r.  

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI) jest białkiem antykoagulacyjnym, które blokuje fazę inicjacji procesu krzepnięcia przez czynnik tkankowy (TF) w układzie zewnątrzpochodnym. TFPI działa  w komórkach prezentujących TF na powierzchni oraz w miejscach urazu, gdzie jest ważnym regulatorem krwawienia w hemofilii. Główne izoformy TFPI, tj. TFPIα i TFPIβ, występują w różnych miejscach w naczyniach krwionośnych oraz w przestrzeni pozanaczyniowej. Obie formy bezpośrednio hamują czynnik Xa (FXa) i czynnik VIIa (FVIIa) poprzez swoją domenę Kunitz 1 i 2.

Analizator funkcji płytek krwi (PFA, Platelet Function Analyser; Siemens) jest popularnym narzędziem do badania funkcji płytek krwi, pierwotnie opisanym ponad 25 lat temu jako „czas krwawienia in vitro”.  Oryginalny analizator PFA-100 (zastępowany obecnie przez model PFA-200) jest szeroko stosowany na całym świecie. Analizatory te przedstawiają wyniki testu jako „czas zamknięcia (okluzji)” (CT), w którym otwór w membranie wkładu testowego zostanie zablokowany. Analizator wymaga wprowadzenia pełnej krwi, która przepływa przez wkład pod zwykłym ciśnieniem i wchodzi w kontakt z błoną testową (membraną) pokrytą różnymi agonistami płytek krwi. Płytki krwi przylegają do błony, a następnie ulegają aktywacji i agregacji, ostatecznie zamykając otwór. Istnieją trzy różne typy wkładów testowych, w zależności od stosowanych agonistów płytkowych: kolagen/epinefryna (Col/Epi), kolagen/difosforan adenozyny (Col/ADP) i „Innovance PFA P2Y” - wkład powlekany ADP, prostaglandyną E1 i chlorkiem wapnia (wrażliwy na terapię antagonistą P2Y12 - klopidogrelem).

D-dimer jest fragmentem usieciowanej fibryny, powstałym w wyniku rozszczepienia skrzepów fibrynowych przez plazminę, a zatem pośrednim biomarkerem aktywacji układu hemostazy. Na początku pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) w kilku badaniach opisano zaburzenia krzepnięcia u pacjentów dotkniętych chorobą, w tym wysoki poziom dimeru  D (D-D). Głównym zastosowaniem oznaczeń D-D jest wykluczenie zatorowości płucnej i zakrzepicy żył głębokich u pacjentów z niskim lub średnim podejrzeniem klinicznym. Oznaczenie stężenia D-D jest również używane do oceny ryzyka nawrotu żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) oraz jest włączone do algorytmu ISTH w diagnostyce rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC). W licznych badaniach u pacjentów hospitalizowanych z powodu zakażenia COVID-19 stwierdzono wysokie poziomy D-D, które uznano za niekorzystny wskaźnik rokowniczy.

Nabyta hemofilia A (AHA, acquired haemophilia A) jest chorobą autoimmunologiczną wywołaną przez autoprzeciwciała skierowane przeciwko ludzkiemu czynnikowi krzepnięcia VIII (FVIII). W ostatnim czasie do leczenia krwawień u pacjentów z AHA wprowadzono nowy lek, tj. koncentrat rekombinowanego wieprzowego czynnika VIII (rpFVIII, recombinant porcine factor VIII), w przypadku którego, istotne jest regularne monitorowanie laboratoryjne w celu oceny skuteczności leczenia. Opublikowane przez Bowyer A. i wsp. w 2022 roku wytyczne Brytyjskiej Organizacji Leczenia Hemofilii (UKHCDO), przygotowane w wyniku analizy najnowszego piśmiennictwa w tej dziedzinie, mają na celu ugruntowanie i aktualizację zaleceń dotyczących laboratoryjnego monitorowania rpFVIII u pacjentów z AHA.

Uważa się, że jad węży jest jednym z najbogatszych naturalnych źródeł składników aktywnych biologicznie i farmakologicznie [1]. Jest to złożona mieszanina wolnych aminokwasów, amin, lipidów, niskocząsteczkowych węglowodanów, jonów metali, nukleozydów, a przede wszystkim białek i peptydów. Jady węży zawierają jedne z najsilniejszych naturalnych toksyn, ewolucyjnie ukierunkowanych na  unieruchomienie i zabicie ofiary. Są to składniki hemotoksyczne, które można skutecznie wykorzystać w badaniach laboratoryjnych i diagnostyce zaburzeń hemostazy. Najczęściej stosowane są enzymy trombinopodobne, oporne na heparynę i bezpośrednie inhibitory trombiny, które mogą pomóc w potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności inhibitorów trombiny w osoczu. Perełką wśród aktywatorów krzepnięcia jest jad żmii Russella, ponieważ zawiera on aktywatory czynnika X i V. Jest stosowany w szeregu testów opartych na krzepnięciu, takich jak ocena niedoborów czynników V i X, niedoborów białek C i S, aktywowanej oporności na białko C (APCR) oraz najważniejszego testu wykrywającego antykoagulant tocznia, jakim jest oznaczenie czasu krzepnięcia  w obecności rozcieńczonego jadu żmii Russella (dRVVT).

Choroba von Willebranda (VWD, von Willebrand disease) to wrodzona osoczowa skaza krwotoczna spowodowana defektem multimerycznej glikoproteiny osocza – czynnika von Willebranda (VWF, von Willebrand factor). Podstawowym kryterium klasyfikacji VWD jest rodzaj defektu VWF. Zarówno ilościowe jak i jakościowe nieprawidłowości tego białka prowadzą do utraty funkcji jaką VWF pełni w procesach hemostazy pierwotnej i wtórnej. Typ 1 oraz typ 3 VWD to zaburzenia ilościowe VWF, przy czym typ 1 definiuje się jako częściowy niedobór, natomiast typ 3 charakteryzuje się całkowitym niedoborem VWF. 

Trombina jest wielofunkcyjną proteazą serynową i posiada szeroki zakres różnorodnych funkcji biologicznych. Enzym ten od odkrycia w XIX wieku był przedmiotem intensywnych badań. Jest to centralny enzym bioregulacyjny w hemostazie, o działaniu zarówno prokoagulacyjnym, jak i/lub przeciwzakrzepowym. Wiadomo, że trombina rozszczepia wiele fizjologicznie ważnych substratów, w tym fibrynogen, czynniki krzepnięcia V i VIII, a także kilka receptorów aktywowanych proteazą (PAR) oraz białko C.

Czynnik krzepnięcia (FIX) jest białkiem zależnym od witaminy K, a jego niedobór powoduje skazę krwotoczną - hemofilię B (HB) – uwarunkowaną genetycznie chorobę recesywną związaną z chromosomem X. W odróżnieniu od hemofilii A, HB występuje znacznie rzadziej i stanowi około 15-20 % wszystkich przypadków hemofilii, częstość jej występowania wynosi około 1 na 30 000 żywo urodzonych chłopców. Nasilenie krwawień w HB skorelowane jest z aktywnością FIX:C w osoczu pacjenta, wyróżnia się postać: ciężką [FIX:C <1% (<0,01 IU/mL)], umiarkowaną [FIX:C 1-5% (0,01-0,05 IU/mL)] oraz łagodną [FIX:C 5-40% (0,05-0,40 j.m./ml)].

W pełni zautomatyzowane analizatory układu krzepnięcia są integralną częścią nowoczesnych laboratoriów klinicznych. Najwyższej klasy przyrządy ułatwiają analizy koagulometryczne, chromogenne i immunologiczne, zapewniają algorytmy testów przedanalitycznych, optymalizują zarządzanie próbkami, odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi oraz posiadają funkcję pobierania osocza po przebiciu korka. 

Bezpośrednie doustne antykoagulanty (DOAC) są szeroko stosowane klinicznie i dlatego często są obecne w próbkach krwi pacjentów przesyłanych do badań laboratoryjnych. Najczęściej stosowane są: dabigatran (inhibitor trombiny), oraz rywaroksaban, apiksaban  edoksaban  i betrixaban (bezpośrednie inhibitory czynnika Xa). Interferencja DOAC dotyczy w różnym stopniu większości testów krzepnięcia, co wynika z zasady działania testów krzepnięcia, wykorzystujących trombinę i/lub czynnik Xa, czyli enzymy będące celem działania dwóch głównych typów DOAC.

Antykoagulant toczniowy (LA) jest częścią heterogennej rodziny autoprzeciwciał ukierunkowanych na ujemnie naładowane fosfolipidy (PL) w kompleksie z  białkami. Termin LA jest w rzeczywistości mylący, ponieważ obecność LA w osoczu powoduje wydłużenie czasu krzepnięcia mierzonego testami zależnymi od PL, takimi jak czas częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji (APTT) i test z rozcieńczonym jadem żmii Russella (dRVVT). Natomiast obecność LA „paradoksalnie” wiąże się z zakrzepicą (żylną i/lub tętniczą) oraz powikłaniami ciąży. Obecność LA jest jednym z trzech kryteriów laboratoryjnych charakteryzujących zespół antyfosfolipidowy (APS).

Określenie profilu krzepnięcia pacjenta, czyli wykrycie skłonności do krwawień lub ryzyka zakrzepicy, ma kluczowe znaczenie dla klinicystów. Rutynowe i specjalistyczne testy krzepnięcia nie zawsze pozwalają na charakterystykę równowagi hemostatycznej. Test generacji trombiny (TGA) jest globalnym testem dynamicznym, mierzącym jednocześnie i w sposób ciągły wytwarzanie i hamowanie trombiny (TG), dlatego odzwierciedla aktywność prokoagulacyjną i antykoagulacyjną w osoczu. TGA jest szeroko stosowany w diagnostyce, ocenie rokowania, monitorowaniu profilaktyki i leczenia dziedzicznych i nabytych skaz krwotocznych i zakrzepicy. Ponadto wykazano, że TGA dostarcza istotnych informacji do diagnozowania koagulopatii wywołanych chorobami zakaźnymi, obejmujących również zaburzenia układu krzepnięcia w przebiegu COVID-19 [1-3]. 

Stworzenie aktualizacji stało się niezbędne, ponieważ, oryginalne zalecenia podkomitetu ISTH, dotyczące zasad oznaczania antykoagulantu tocznia (LA, lupus anticoagulant) pochodzą z 2009 roku [1].

Historia  antykoagulantu tocznia ma już 70 lat. W 1952 r. Conley i Hartmann opisali po raz pierwszy u chorych na toczeń rumieniowaty przedłużenie czasów krzepnięcia, zależnych od fosfolipidów. W 1972 roku Feinstein i Rapaport nazwali to zjawisko antykoagulantem toczniowym  [2]. Obecnie wiemy, iż spośród wszystkich laboratoryjnych kryteriów zespołu antyfosfolipidowego (antiphospholipid syndrome = APS) LA wiąże się najsilniej z powikłaniami zakrzepowymi zespołu [3]. Zatem jego oznaczanie stanowi jedną z podstaw laboratoryjnej diagnostyki zespołu antyfosfolipidowego.