Laboratorium Hemostazy - Artykuły

Testy lepkosprężyste (do których zalicza się testy wiskoelastometryczne – VET, tj. tromboelastografię - TEG i tromboelastometrię - TEM) są to globalne metody badania krzepnięcia, które oceniają fizyczne właściwości tworzenia się skrzepu w próbce krwi pełnej in vitro w czasie rzeczywistym. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod badania układu krzepnięcia, VET uwzględnia wiele fizjologicznych czynników przyczyniających się do powstawania skrzepów, takich jak liczba i funkcja płytek krwi, polimeryzacja fibryny i inne osoczowe czynniki krzepnięcia, a także udział krwinek czerwonych i leukocytów. 

Zespół antyfosfolipidowy (APS) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się obecnością przeciwciał skierowanych przeciwko ujemnie naładowanym fosfolipidom połączonym z białkami. Obecność tych przeciwciał bardzo często ma związek z zakrzepicą (żylną i/lub tętniczą) oraz powikłaniami ciąży. Istotna jest diagnostyka laboratoryjna APS, ponieważ utrzymujący się pozytywny wynik badań laboratoryjnych wskazuje na konieczność długoterminowej antykoagulacji. Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy w ramach diagnostyki laboratoryjnej APS przeprowadza się pomiar miana przeciwciał przeciwko kardiolipinie (aCL) i β2-glikoproteinie-I (aβ2-GPI) oraz testy na obecność antykoagulantu toczniowego (LA). Potrójna pozytywność (tj. jednoczesna obecność aCL, aβ2-GPI i LA) charakteryzuje pacjentów z większym ryzykiem zdarzeń klinicznych niż pojedyncza lub podwójna pozytywność [1,2].

Hemofilia B (HB) charakteryzuje się obniżonym poziomem aktywności czynnika krzepnięcia IX (FIX:C). Klasyfikacja ciężkości hemofilii jest definiowana na podstawie stopnia niedoboru FIX jako typ ciężki (FIX:C <0,01 IU/ml), umiarkowany (0,01 - <0,05 IU/ml) lub łagodny (≥0,05 - <0,40 IU/mL). Dokładny i precyzyjny pomiar FIX:C służy rozpoznawaniu, klasyfikacji ciężkości HB i wspomaga decyzje kliniczne dotyczące leczenia substytucyjnego. Jest to szczególnie istotne przy aktywności FIX:C w najniższym zakresie wartości, gdzie fenotyp krwawienia i strategia leczenia mogą się znacznie różnić.

Antykoagulant toczniowy (LA) jest zależnym od fosfolipidów inhibitorem krzepnięcia, wykrywanym w laboratoriach klinicznych jako przedłużenie testów (czasów) krzepnięcia, w których stosuje się ograniczone stężenie fosfolipidów. Zjawisko to jest spowodowane obecnością przeciwciał antyfosfolipidowych, które mogą być obecne w przebiegu chorób autoimmunologicznych lub przejściowo po infekcjach (np. wirusowych). Utrzymujący się LA wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. 

Przedstawione w omawianym artykule wytyczne zostały przygotowane w imieniu Międzynarodowej Rady Normalizacji w Hematologii (ICSH). Celem dokumentu jest określenie wskazówek i zaleceń dotyczących oznaczania inhibitorów czynnika VIII (FVIII) i IX (FIX). W ramach tej pracy omówiono testy przesiewowe w kierunku inhibitorów, zasady oznaczania, wymagania dotyczące próbek oraz testów i ich interpretacja, zapewnienie jakości, interferencje i najnowsze osiągnięcia. Niniejsze wytyczne koncentrują się na zaleceniach dotyczących wystandaryzowanej procedury oznaczania laboratoryjnego inhibitorów FVIII i FIX typu I. Zalecenia opierają się na danych opublikowanych w recenzowanej literaturze i opiniach ekspertów.

Fibrynoliza jest serią reakcji enzymatycznych, podczas których dochodzi do rozkładu nierozpuszczalnej fibryny. Aktywatory plazminogenu przekształcają zymogen plazminogenu w aktywną plazminę - proteazę serynową, która rozszczepia i rozpuszcza sieci fibrynowe do produktów degradacji fibryny (FDP) [1]. Fibrynoliza zależy od ilości i jakości różnych enzymów fibrynolitycznych, takich jak tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i plazmina, ich inhibitorów: inhibitora aktywatora plazminogenu typu 1 (PAI-1) i alfa-2-antyplazminy (α₂AP) oraz struktury skrzepu. Fibrynoliza jest dodatkowo regulowana przez inhibitor fibrynolizy aktywowany przez trombinę (TAFI, proCPU), który hamuje aktywację przemian plazminogenu przez tPA [2,3].

Wytyczne zostały opracowane w imieniu Międzynarodowej Rady ds. Standaryzacji w Hematologii (ICSH) i skupiają się na dwóch testach koagulologicznych wykonywanych w miejscu opieki nad pacjentem (POC), a mianowicie na oznaczeniu czasu protrombinowego i wyznaczeniu Międzynarodowego Znormalizowanego Współczynnika (INR) oraz oznaczeniu dimeru D (D-D). Opieka podstawowa obejmuje placówki przyszpitalne i pozaszpitalne, a niniejsze wytyczne są przeznaczone do użytku przez pracowników służby zdrowia wykonujących testy INR lub D-D. Zalecenia opierają się na danych opublikowanych w recenzowanym piśmiennictwie oraz opiniach ekspertów i powinny stanowić uzupełnienie regionalnych wymagań i przepisów.

Wrodzony niedobór czynnika XI (FXI) jest rzadkim zaburzeniem krzepnięcia, które może skutkować nadmiernym krwawieniem wymagającym leczenia w celu przywrócenia równowagi układu hemostazy. Niedobór FXI cechuje zmienny fenotyp występowania krwawień, przy czym ciężkie spontaniczne krwawienia są dość rzadkie. Z tego powodu szacuje się, że to zaburzenie hemostazy może pozostać niezdiagnozowane u wielu osób.

Emicizumab (Hemlibra, Roche Chugai, Zurych, Szwajcaria) jest bispecyficznym przeciwciałem, które rozpoznaje zarówno zymogen, jak i aktywowane formy ludzkich czynników IX i X (FIX, FX). Lek ten działa w celu zastąpienia czynnika VIII (FVIII) w kompleksie tenazy i jest zarejestrowany w wielu krajach jako leczenie profilaktyczne krwawień u pacjentów z hemofilią A (HA) z inhibitorami FVIII, a ostatnio także w ciężkiej HA bez inhibitorów.

Na testy krzepnięcia w laboratorium wpływa wiele zmiennych, co może prowadzić do błędnych wyników oraz niewłaściwych decyzji diagnostycznych i terapeutycznych, podejmowanych przez klinicystę. Zakłócenia należą do trzech głównych grup: (1) zakłócenia biologiczne —  wynikające z rzeczywistego upośledzenia układu krzepnięcia pacjenta (wrodzonego lub nabytego); (2) zakłócenia fizyczne — spowodowane błędami przedanalitycznymi; oraz (3) interferencje chemiczne – spowodowane obecnością leków (w tym głównie antykoagulantów) w badanej próbce.

W dniach 23-24 marca w Warszawie odbyła się stacjonarna konferencja naukowo-szkoleniowa „Koagulologia praktyczna i nie tylko…”. Jest to cykliczne wydarzenie przeznaczone dla diagnostów laboratoryjnych, organizowane przez firmę Werfen Polska, jednego z głównych dostawców analizatorów i odczynników do diagnostyki koagulologicznej na rynku polskim. Tegoroczna konferencja zgromadziła liczną rzeszę diagnostów laboratoryjnych – ponad 140 uczestników z całej Polski.

Opracowanie zakresu wartości referencyjnych (ZWR), niezbędnego do prawidłowej oceny wyników badań układu krzepnięcia, jest wyzwaniem dla każdego laboratorium, a szczególnie laboratorium hemostazy, ze względu na badanie próbek o ograniczonej stabilności przy użyciu różnorodnej kombinacji odczynników i aparatury. W wielu laboratoriach brakuje czasu, środków finansowych oraz wiedzy i doświadczenia, aby przeprowadzić to postępowanie zgodnie z zalecanymi procedurami.

Dimer D (D-D) jest biomarkerem jednoczesnej aktywacji krzepnięcia i fibrynolizy, rutynowo stosowanym w celu wykluczenia zatoru tętnicy płucnej (ZTP) i/lub żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ), w połączeniu z kliniczną oceną prawdopodobieństwa. Wykorzystanie i zastosowanie testów zależy w dużej mierze od rodzaju użytego testu. Wyniki testów do oznaczania D-D mogą być obarczone błędami występującymi w fazie przedanalitycznej, analitycznej i poanalitycznej. Dlatego istotna jest decyzja o celowości badań D-D w rozpoznawaniu ZTP i ŻChZZ oraz omówienie zmiennych, które mogą wpływać na jakość oceny laboratoryjno – klinicznej.

Termin trombofilia odnosi się do zaburzeń krzepnięcia krwi, prowadzących do zwiększonego ryzyka żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (VTE, Venous Thromboembolism). VTE jest dość powszechną chorobą, która obejmuje zarówno zakrzepicę żył głębokich (DVT), jak i zatorowość płucną (PE). DVT dotyczy zwykle żył głębokich kończyn dolnych, rzadziej rozwija się w innych lokalizacjach.

Antykoagulacja za pomocą bezpośrednich doustnych antykoagulantów (DOAC) jest podstawą leczenia wielu chorób sercowo-naczyniowych i zakrzepowych. Niestety obecność DOAC we krwi może zakłócać laboratoryjne testy krzepnięcia, w tym testy w kierunku trombofilii i obecności antykoagulantu tocznia. W celu wyeliminowania interferencji DOAC na poziomie laboratorium, opracowano i wprowadzono do użycia odczynniki na bazie węgla aktywnego (np. DOAC-stop™). 

Aktywowane białko C (APC) wraz z jego kofaktorami: białkiem S (PS) i czynnikiem V (FV), działa jako naturalny antykoagulant poprzez proteolityczne cięcie aktywowanych czynników: V (FVa) i  VIII (FVIIIa). Zaburzenia czynnościowe układu białka C (PC), objawiające się in vitro zmniejszoną odpowiedzią antykoagulacyjną osocza na APC, wiążą się ze zwiększonym ryzykiem żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) wynikającym z oporności na działanie APC.

Monitorowanie leczenia antagonistami witaminy K (VKA) wymaga częstych pomiarów czasu protrombinowego (PT), z wynikami wyrażonymi jako międzynarodowy współczynnik znormalizowany (INR), które są wykorzystane do dostosowania dawki leku. Obliczenie INR wymaga znajomości międzynarodowego wskaźnika czułości tromboplastyny (ISI) oraz średniej geometrycznej normalnego PT (MNPT) i jest obliczane dla ≥20 zdrowych osób i określone dla kombinacji tromboplastyna/koagulometr. Zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), wartość ISI należy wyznaczyć, badając PT osocza pacjentów ustabilizowanych na VKA i osób zdrowych, za pomocą kalibrowanego zestawu tromboplastyna/koagulometr i standardu tromboplastyny.

Hemostaza jest złożonym procesem, w którym bierze udział wiele czynników,  w tym płytki krwi, czynniki krzepnięcia i składniki śródbłonka naczyniowego. Idealny test hemostazy powinien umożliwić ocenę wszystkich wyżej wymienionych procesów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, wykorzystując niewielką ilość krwi i dostarczając wyniki w jak najkrótszym czasie. Powszechnie stosowane badania laboratoryjne zaburzeń hemostazy obejmują oddzielną ocenę różnych składników procesu krzepnięcia, w tym ocenę liczby i funkcji płytek krwi, pomiary czynników pro- i antykoagulacyjnych oraz pro- i antyfibrynolitycznych. 

Wątroba odgrywa kluczową rolę w aktywacji i regulacji układu hemostazy, ponieważ jest miejscem syntezy wielu białek zaangażowanych w proces krzepnięcia krwi. Zaawansowana choroba wątroby prowadzi do złożonych zmian hemostazy pierwotnej i wtórnej oraz fibrynolizy [1]. Historycznie uważano, że przeciwzakrzepowe zmiany w chorobach wątroby, takie jak małopłytkowość oraz niski poziom białek krzepnięcia i fibrynolizy sugerują, że pacjenci z marskością wątroby są narażeni na wysokie ryzyko krwawienia, oraz chronieni są przed zakrzepicą.

Analizator do badania funkcji płytek krwi (PFA, Platelet Function Analyser; Siemens Healthineers) jest powszechnie znanym narzędziem do przesiewowego badania czynności płytek krwi. Analizator ten opracowano 50 lat temu, pojawił się on na rynku w połowie lat 90-tych, a obecnie dostępny jest na rynku europejskim w dwóch modelach, tj. PFA-100 i PFA-200. Oba instrumenty działają w oparciu o pomiar tzw. czasu zamknięcia (CT, Closure Time). Pomiar CT był pierwotnie postrzegany jako równoważnik stosowanego wówczas pomiaru czasu krwawienia i przez pewien czas był znany jako „czas krwawienia in vitro”.

Hemofilia B jest uwarunkowaną genetycznie skazą krwotoczną, spowodowaną brakiem lub zmniejszeniem syntezy osoczowego czynnika krzepnięcia IX (FIX). Na podłoże molekularne hemofilii B składa się dość duża liczba (> 1200) różnych wariantów genetycznych o różnej lokalizacji, co dowodzi znacznej heterogenności tej skazy krwotocznej. Fenotyp krwotoczny hemofilii B nie zawsze idealnie koreluje z aktywnością koagulacyjną FIX:C w osoczu, dlatego poznanie mechanizmu molekularnego hemofilii B może być pomocne w zrozumieniu niejednorodności fenotypu krwotocznego i pogłębieniu wiedzy na temat diagnozowania i leczenia pacjentów obarczonych tą chorobą. W niniejszym artykule przedstawiono uwarunkowania molekularne hemofilii B wraz z omówieniem ich patomechanizmu w poszczególnych domenach FIX.

Trombomodulina (TM) jest transbłonową glikoproteiną typu I, odkrytą w 1981 roku na powierzchni komórek śródbłonka, jako kofaktor aktywacji białka C w reakcji katalizowanej przez trombinę. TM znaleziono na wielu różnych komórkach, w tym na makrofagach, monocytach, płytkach krwi, neutrofilach i komórkach mezotelium [1]. Śródbłonkowa, jednołańcuchowa TM o masie cząsteczkowej około 74 kDa, składa się z 557 aminokwasów. Strukturę dojrzałej TM tworzy pięć domen: domena lektynopodobna (TMD1), domena podobna do naskórkowego czynnika wzrostu - EGF (TMD2), domena bogata w serynę/treoninę (TMD3), domena transbłonowa (TMD4) oraz „ogon” cytozolowy (TMD5).