Laboratorium Hemostazy - Artykuły

Zapraszamy do zapoznania się z relacją cyfrową z XXX Zjazdu PTHIT, zarejestrowaną podczas sesji dotyczącej diagnostyki laboratoryjnej w hemostazie.

Laboratorium kliniczne staje przed istotnym dylematem związanym z monitorowaniem leczenia bezpośrednimi doustnymi antykoagulantami (DOAC), obejmującymi bezpośredni inhibitor trombiny, eteksylan dabigatranu i trzy bezpośrednie inhibitory FXa: apiksaban, edoksaban i rywaroksaban: czy i w jaki sposób monitorować efekty ich działania. DOAC mają przewidywalne właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne w przypadku dawek ustalonych dla zatwierdzonych wskazań i nie wymagają rutynowego monitorowania w tym samym kontekście, co tradycyjne doustne leki przeciwzakrzepowe (VKA).  Obecnie wiadomo, że posiadanie przez laboratorium możliwości wykrywania lub pomiaru ilościowego DOAC może być korzystne w przypadku ostrych stanów, takich jak uraz, pilna operacja, udar mózgu i inne.  Pewne populacje pacjentów, do których należą osoby: starsze, szczupłe lub nadmiernie otyłe, z zaburzeniami czynności nerek, z podejrzeniem przedawkowania lub interakcji leków, mogą również wymagać takiej oceny. 

Złożone procesy krzepnięcia są zależne od procesów adhezji i aktywacji płytek krwi. Funkcja prokoagulacyjna płytek krwi jest związana z prawidłowym funkcjonowaniem szeregu mechanizmów.

VWD może być błędnie zdiagnozowana jako zupełnie inna skaza krwotoczna. Jeśli nie zostanie wykonany odpowiedni panel badań laboratoryjnych ukierunkowanych na VWD, to np. u pacjenta z ciężką postacią VWD typu 3 nieumyślnie może zostać zdiagnozowana hemofilia A, ze względu na niską aktywność FVIII stwierdzaną w obu tych schorzeniach.

ADAMTS13 jest metaloproteazą osocza, która reguluje multimeryczną wielkość czynnika von Willebranda poprzez rozszczepianie sekwencji aminokwasowej białka Tyr1605-Met1606. Niedobór ADAMTS13 (nabyty lub wrodzony) występuje w zakrzepowej plamicy małopłytkowej (TTP, thrombotic thrombocytopenic purpura).  TTP należy do grupy chorób określanych jako mikroangiopatie zakrzepowe (TMA, thrombotic microangiopathy), u podstaw których leży uogólniona zakrzepica tętniczek i naczyń włosowatych [1]. Wyróżnia się postać wrodzoną TTP (cTTP, congenital TTP), uwarunkowaną mutacjami w genie kodującym ADAMTS13 (tzw. zespół Upshaw-Schulmana, USS), oraz nabytą - immunologiczną (iTTP, immune mediated TTP), wynikającą z obecności autoprzeciwciał anty-ADAMTS13, czyli tzw. inhibitora [1].

Pojęcie „wyroby medyczne do diagnostyki in vitro (IVD)” obejmuje testy stosowane dla próbek biologicznych, służące wykrywaniu i monitorowaniu przebiegu chorób oraz diagnozowaniu i ich prognozowaniu w warunkach klinicznych, jak również testy genetyczne, co znacznie zwiększa zastosowanie IVD w różnych sytuacjach klinicznych.  W dniu 26 maja 2017 r. Parlament Europejski i Rada Unii Europejskiej przyjęły nowe rozporządzenie w sprawie wyrobów medycznych do diagnostyki in vitro (IVDR) – Rozporządzenie UE 2017/746 – planowane do wprowadzenia od 26 maja 2022 r.  

Inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI) jest białkiem antykoagulacyjnym, które blokuje fazę inicjacji procesu krzepnięcia przez czynnik tkankowy (TF) w układzie zewnątrzpochodnym. TFPI działa  w komórkach prezentujących TF na powierzchni oraz w miejscach urazu, gdzie jest ważnym regulatorem krwawienia w hemofilii. Główne izoformy TFPI, tj. TFPIα i TFPIβ, występują w różnych miejscach w naczyniach krwionośnych oraz w przestrzeni pozanaczyniowej. Obie formy bezpośrednio hamują czynnik Xa (FXa) i czynnik VIIa (FVIIa) poprzez swoją domenę Kunitz 1 i 2.

Analizator funkcji płytek krwi (PFA, Platelet Function Analyser; Siemens) jest popularnym narzędziem do badania funkcji płytek krwi, pierwotnie opisanym ponad 25 lat temu jako „czas krwawienia in vitro”.  Oryginalny analizator PFA-100 (zastępowany obecnie przez model PFA-200) jest szeroko stosowany na całym świecie. Analizatory te przedstawiają wyniki testu jako „czas zamknięcia (okluzji)” (CT), w którym otwór w membranie wkładu testowego zostanie zablokowany. Analizator wymaga wprowadzenia pełnej krwi, która przepływa przez wkład pod zwykłym ciśnieniem i wchodzi w kontakt z błoną testową (membraną) pokrytą różnymi agonistami płytek krwi. Płytki krwi przylegają do błony, a następnie ulegają aktywacji i agregacji, ostatecznie zamykając otwór. Istnieją trzy różne typy wkładów testowych, w zależności od stosowanych agonistów płytkowych: kolagen/epinefryna (Col/Epi), kolagen/difosforan adenozyny (Col/ADP) i „Innovance PFA P2Y” - wkład powlekany ADP, prostaglandyną E1 i chlorkiem wapnia (wrażliwy na terapię antagonistą P2Y12 - klopidogrelem).

D-dimer jest fragmentem usieciowanej fibryny, powstałym w wyniku rozszczepienia skrzepów fibrynowych przez plazminę, a zatem pośrednim biomarkerem aktywacji układu hemostazy. Na początku pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) w kilku badaniach opisano zaburzenia krzepnięcia u pacjentów dotkniętych chorobą, w tym wysoki poziom dimeru  D (D-D). Głównym zastosowaniem oznaczeń D-D jest wykluczenie zatorowości płucnej i zakrzepicy żył głębokich u pacjentów z niskim lub średnim podejrzeniem klinicznym. Oznaczenie stężenia D-D jest również używane do oceny ryzyka nawrotu żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) oraz jest włączone do algorytmu ISTH w diagnostyce rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC). W licznych badaniach u pacjentów hospitalizowanych z powodu zakażenia COVID-19 stwierdzono wysokie poziomy D-D, które uznano za niekorzystny wskaźnik rokowniczy.

Nabyta hemofilia A (AHA, acquired haemophilia A) jest chorobą autoimmunologiczną wywołaną przez autoprzeciwciała skierowane przeciwko ludzkiemu czynnikowi krzepnięcia VIII (FVIII). W ostatnim czasie do leczenia krwawień u pacjentów z AHA wprowadzono nowy lek, tj. koncentrat rekombinowanego wieprzowego czynnika VIII (rpFVIII, recombinant porcine factor VIII), w przypadku którego, istotne jest regularne monitorowanie laboratoryjne w celu oceny skuteczności leczenia. Opublikowane przez Bowyer A. i wsp. w 2022 roku wytyczne Brytyjskiej Organizacji Leczenia Hemofilii (UKHCDO), przygotowane w wyniku analizy najnowszego piśmiennictwa w tej dziedzinie, mają na celu ugruntowanie i aktualizację zaleceń dotyczących laboratoryjnego monitorowania rpFVIII u pacjentów z AHA.

Uważa się, że jad węży jest jednym z najbogatszych naturalnych źródeł składników aktywnych biologicznie i farmakologicznie [1]. Jest to złożona mieszanina wolnych aminokwasów, amin, lipidów, niskocząsteczkowych węglowodanów, jonów metali, nukleozydów, a przede wszystkim białek i peptydów. Jady węży zawierają jedne z najsilniejszych naturalnych toksyn, ewolucyjnie ukierunkowanych na  unieruchomienie i zabicie ofiary. Są to składniki hemotoksyczne, które można skutecznie wykorzystać w badaniach laboratoryjnych i diagnostyce zaburzeń hemostazy. Najczęściej stosowane są enzymy trombinopodobne, oporne na heparynę i bezpośrednie inhibitory trombiny, które mogą pomóc w potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności inhibitorów trombiny w osoczu. Perełką wśród aktywatorów krzepnięcia jest jad żmii Russella, ponieważ zawiera on aktywatory czynnika X i V. Jest stosowany w szeregu testów opartych na krzepnięciu, takich jak ocena niedoborów czynników V i X, niedoborów białek C i S, aktywowanej oporności na białko C (APCR) oraz najważniejszego testu wykrywającego antykoagulant tocznia, jakim jest oznaczenie czasu krzepnięcia  w obecności rozcieńczonego jadu żmii Russella (dRVVT).

Choroba von Willebranda (VWD, von Willebrand disease) to wrodzona osoczowa skaza krwotoczna spowodowana defektem multimerycznej glikoproteiny osocza – czynnika von Willebranda (VWF, von Willebrand factor). Podstawowym kryterium klasyfikacji VWD jest rodzaj defektu VWF. Zarówno ilościowe jak i jakościowe nieprawidłowości tego białka prowadzą do utraty funkcji jaką VWF pełni w procesach hemostazy pierwotnej i wtórnej. Typ 1 oraz typ 3 VWD to zaburzenia ilościowe VWF, przy czym typ 1 definiuje się jako częściowy niedobór, natomiast typ 3 charakteryzuje się całkowitym niedoborem VWF. 

Trombina jest wielofunkcyjną proteazą serynową i posiada szeroki zakres różnorodnych funkcji biologicznych. Enzym ten od odkrycia w XIX wieku był przedmiotem intensywnych badań. Jest to centralny enzym bioregulacyjny w hemostazie, o działaniu zarówno prokoagulacyjnym, jak i/lub przeciwzakrzepowym. Wiadomo, że trombina rozszczepia wiele fizjologicznie ważnych substratów, w tym fibrynogen, czynniki krzepnięcia V i VIII, a także kilka receptorów aktywowanych proteazą (PAR) oraz białko C.

Czynnik krzepnięcia (FIX) jest białkiem zależnym od witaminy K, a jego niedobór powoduje skazę krwotoczną - hemofilię B (HB) – uwarunkowaną genetycznie chorobę recesywną związaną z chromosomem X. W odróżnieniu od hemofilii A, HB występuje znacznie rzadziej i stanowi około 15-20 % wszystkich przypadków hemofilii, częstość jej występowania wynosi około 1 na 30 000 żywo urodzonych chłopców. Nasilenie krwawień w HB skorelowane jest z aktywnością FIX:C w osoczu pacjenta, wyróżnia się postać: ciężką [FIX:C <1% (<0,01 IU/mL)], umiarkowaną [FIX:C 1-5% (0,01-0,05 IU/mL)] oraz łagodną [FIX:C 5-40% (0,05-0,40 j.m./ml)].

W pełni zautomatyzowane analizatory układu krzepnięcia są integralną częścią nowoczesnych laboratoriów klinicznych. Najwyższej klasy przyrządy ułatwiają analizy koagulometryczne, chromogenne i immunologiczne, zapewniają algorytmy testów przedanalitycznych, optymalizują zarządzanie próbkami, odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi oraz posiadają funkcję pobierania osocza po przebiciu korka. 

Bezpośrednie doustne antykoagulanty (DOAC) są szeroko stosowane klinicznie i dlatego często są obecne w próbkach krwi pacjentów przesyłanych do badań laboratoryjnych. Najczęściej stosowane są: dabigatran (inhibitor trombiny), oraz rywaroksaban, apiksaban  edoksaban  i betrixaban (bezpośrednie inhibitory czynnika Xa). Interferencja DOAC dotyczy w różnym stopniu większości testów krzepnięcia, co wynika z zasady działania testów krzepnięcia, wykorzystujących trombinę i/lub czynnik Xa, czyli enzymy będące celem działania dwóch głównych typów DOAC.

Antykoagulant toczniowy (LA) jest częścią heterogennej rodziny autoprzeciwciał ukierunkowanych na ujemnie naładowane fosfolipidy (PL) w kompleksie z  białkami. Termin LA jest w rzeczywistości mylący, ponieważ obecność LA w osoczu powoduje wydłużenie czasu krzepnięcia mierzonego testami zależnymi od PL, takimi jak czas częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji (APTT) i test z rozcieńczonym jadem żmii Russella (dRVVT). Natomiast obecność LA „paradoksalnie” wiąże się z zakrzepicą (żylną i/lub tętniczą) oraz powikłaniami ciąży. Obecność LA jest jednym z trzech kryteriów laboratoryjnych charakteryzujących zespół antyfosfolipidowy (APS).

Określenie profilu krzepnięcia pacjenta, czyli wykrycie skłonności do krwawień lub ryzyka zakrzepicy, ma kluczowe znaczenie dla klinicystów. Rutynowe i specjalistyczne testy krzepnięcia nie zawsze pozwalają na charakterystykę równowagi hemostatycznej. Test generacji trombiny (TGA) jest globalnym testem dynamicznym, mierzącym jednocześnie i w sposób ciągły wytwarzanie i hamowanie trombiny (TG), dlatego odzwierciedla aktywność prokoagulacyjną i antykoagulacyjną w osoczu. TGA jest szeroko stosowany w diagnostyce, ocenie rokowania, monitorowaniu profilaktyki i leczenia dziedzicznych i nabytych skaz krwotocznych i zakrzepicy. Ponadto wykazano, że TGA dostarcza istotnych informacji do diagnozowania koagulopatii wywołanych chorobami zakaźnymi, obejmujących również zaburzenia układu krzepnięcia w przebiegu COVID-19 [1-3]. 

Stworzenie aktualizacji stało się niezbędne, ponieważ, oryginalne zalecenia podkomitetu ISTH, dotyczące zasad oznaczania antykoagulantu tocznia (LA, lupus anticoagulant) pochodzą z 2009 roku [1].

Historia  antykoagulantu tocznia ma już 70 lat. W 1952 r. Conley i Hartmann opisali po raz pierwszy u chorych na toczeń rumieniowaty przedłużenie czasów krzepnięcia, zależnych od fosfolipidów. W 1972 roku Feinstein i Rapaport nazwali to zjawisko antykoagulantem toczniowym  [2]. Obecnie wiemy, iż spośród wszystkich laboratoryjnych kryteriów zespołu antyfosfolipidowego (antiphospholipid syndrome = APS) LA wiąże się najsilniej z powikłaniami zakrzepowymi zespołu [3]. Zatem jego oznaczanie stanowi jedną z podstaw laboratoryjnej diagnostyki zespołu antyfosfolipidowego.

Emicizumab (Hemlibra, Roche Szwajcaria) jest humanizowaną, bispecyficzną, monoklonalną immunoglobuliną G4 (IgG4), która wiąże ludzkie czynniki krzepnięcia (FX, FIX i aktywowany FIXa), aby naśladować aktywność FVIII. W 2017 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) oraz w 2018 roku Europejska Agencja Leków (EMA) zatwierdziły stosowanie emicizumabu u pacjentów z hemofilią A z inhibitorem, a następnie jego stosowanie w profilaktyce u pacjentów z hemofilią A bez inhibitora, ponieważ wykazano znaczne zmniejszenie częstości krwawień w tej grupie pacjentów. Lek ten obecnie jest dopuszczony do użytku klinicznego w wielu krajach.

Choroba von Willebranda (VWD, von Willebrand disease) to skaza krwotoczna wynikająca z ilościowego niedoboru lub jakościowych wad białka czynnika von Willebranda (VWF, von Willebrand factor). Nazwa choroby pochodzi od nazwiska fińskiego lekarza Erika Adolfa von Willebranda, który po raz pierwszy w 1926 roku, opisał u pewnej rodziny rybackiej występowanie częstych krwawienia i krwotoki. Białko, którego niedobór stwierdza się w chorobie von Willebradna odkryto w 1959 roku i  nazwano czynnikiem von Willebranda. Defekty VWF mogą powodować krwawienie poprzez osłabienie adhezji płytek krwi lub poprzez wtórne zmniejszenie stężenia czynnika VIII.

Istnieje wiele zmiennych przedanalitycznych, które wpływają na testy krzepnięcia. Najczęściej analizowany jest sposób pobierania krwi, ale proces zaczyna się od przygotowania pacjenta, gdzie rola laboratorium jest ograniczona. Dobór pacjentów i odpowiedni czas pobrania krwi są integralną częścią zapewnienia właściwej diagnozy i postępowania z pacjentem.  Nadzór laboratoryjny nad transportem, przetwarzaniem i przechowywaniem próbek zapewni integralność próbki do czasu, gdy będzie można przeprowadzić badanie. Celem przedstawionej pracy jest przegląd problemów przedanalitycznych, ze szczególnym uwzględnieniem pacjentów otrzymujących bezpośrednie doustne antykoagulanty (DOAC).